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光學顯微鏡的核心性能指標

時間:2018-12-01

衡量一臺顯微鏡性能的核心技術指標主要包括以下幾個方面:數值孔徑、分辨率、放大率、視野(視場)、景深(焦點深度)、工作距離、鏡像亮度和清晰度。


數值孔徑 數值孔徑是透鏡和聚光鏡的主要技術參數,是判斷兩者(尤其對物鏡而言)性能高低(即消位置色差和倍率色差的能力)的重要標志。其數值的大小,分別標刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。

數值孔徑(N.A.)是透鏡與被檢物體之間介質的折射率(n)和孔徑角半數β的正弦之乘積。用公式表示如下:N.A. = n * sin β??讖浇怯址Q鏡口角,是透鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度??讖浇窃酱?,進入透鏡的光通量就越大,它與透鏡的有效直徑成正比,與焦點的距離成反比。這里必須指出,為了充分發揮物鏡數值孔徑的作用,在觀察時,聚光鏡N.A.值應等于或略大于物鏡的N.A.值。

在顯微鏡系統中,對于給定的物鏡,孔徑角已經固定,若想增大其N.A.值,唯一的辦法是增大介質折射率n值?;谶@一原理,就產生了水浸系物鏡油浸物鏡。因介質的折射率n值大于1,NA值就可能大于1。如果用折射率高的溴萘作介質,溴萘的折射率為1.66,那么NA值可大于1.4。

物鏡類型

消色差物鏡

平場螢石

平場復消色差透鏡

放大倍數

N.A.

分辨率(微米)

N.A.

分辨率(微米)

N.A.

分辨率 (微米)

4倍

0.10

2.75

0.13

2.12

0.20

1.375

10倍

0.25

1.10

0.30

0.92

0.45

0.61

20倍

0.40

0.69

0.50

0.55

0.75

0.37

40倍

0.65

0.42

0.75

0.37

0.95

0.29

60X

0.75

0.37

0.85

0.32

0.95

0.29

100X

1.25

0.22

1.30

0.21

1.40

0.20


分辨率 顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區分的兩個物點的最小間距,又稱"鑒別率"。其計算公式是d=λ/2N.A.;式中d為最小分辨距離;λ為光線的波長;N.A.物鏡數值孔徑。所以分辨率與目鏡沒有關系,目鏡只起“放大鏡”的作用,并不提高顯微鏡的分辨率。

提高分別率的方法主要有兩種:1.提高物鏡的數值孔徑。2.用短波長的光照射,如熒光顯微鏡、電鏡等。

在普通光源照明的條件下,物鏡的分辨距離的極限是多少?

在可見光中亮度最大而且對人眼最敏感的波長為0.55μm,物鏡的最大數值孔徑(N.A.)為1.4,代入公式d=λ/2N.A.,可得d=0.55/2*1.4≈0.2μm。

即在普通照明條件下,光學顯微鏡的分辨距離的極限為0.2μm。

利用紫外線作為光源可以提高物鏡的分辨率(配合熒光物鏡可以實現分辨率的最大化)

紫外線的波長比可見光波長更短,約為0.27μm,通過上述公式d=λ/2N.A.計算可得分辨距離為0.1微米左右,分辨率提高了一倍。


放大率 顯微鏡放大率是指目視顯微鏡形成虛像的角放大率。放大率等于物鏡放大率、目鏡放大率和鏡筒系數的乘積。其公式為:M=m.α=L/f×250/f,其中M表示顯微鏡總放大率,L/f表示物鏡的放大率,250/f表示目鏡的放大率,L表示顯微鏡的光學筒長, f表示物鏡的焦距,f表示目鏡的焦距,250(毫米)表示明視距離。

為什么顯微鏡的放大率不能無限放大?
1)M=m.α=L/f×250/f目,從公式可知,物鏡和目鏡的焦距愈短,光學筒長愈長,總放大率愈大。但焦距太短或鏡筒過長,都會造成工作不方便。因此,顯微鏡的放大率不能無限的增大。
2)顯微鏡的放大率是受分辨率制約的。如果標本的細節不能分開來,過度的放大,毫無意義。

顯微鏡最合適的總放大率(稱為有效放大率,用M有效表示)是在物鏡數值孔徑的500~1000倍之間。即500N.A.≤M有效<1000N.A.,在有效放大率范圍內,眼睛可以長時間觀察而不易疲勞。如果總放大率低于500N.A.,觀察起來很吃力。反之,如果高于1000N.A.,則會使像質變壞,甚至造成不真實的像。


視野 又稱視場field),是指顯微鏡一次所能看到被檢標本的范圍。視野寬度:由于它由目鏡的視場光闌局限成圓形,則把該圓形視野的直徑稱為視野寬度d。

視野寬度與視野的關系:d取決于物鏡的放大倍數及目鏡的光闌大小,小放大倍數和大光闌
可獲得較大的視野。當視野中不能容放整個標本時,要通過機械裝置移動標本進行分區或連續移動觀察。視野(視場)與放大率的關系:視野的大小與放大率成反比,總放大率越大,視野越小。高檔次的顯微鏡會把視野范圍設計的更高,可觀察范圍更大一些,提高了觀察效率及舒適度。


景深(焦點深度)景深又稱焦點深度(focal depth),是指當顯微鏡調焦于某物平面(對準平面)時,位于對準平面前后側的二個仍能清楚觀察的平面間的距離。不僅這一物平面可
以看清楚,而且和它相連的上下物平面也同時看清楚,這上下兩物平面之間的距離叫做焦點深度。

景深與其它參數之間的關系:顯微鏡的數值孔徑越大,景深越??;總放大倍率越大,景深越小。

通過調節孔徑光闌可以改變景深大小


工作距離 顯微鏡工作距離也叫物距(W.D.,Working Distance):指試樣調準焦點時的物鏡前緣與試樣表面(或物鏡使用蓋玻片時,與蓋玻片頂面)的距離。在物鏡數值孔徑一定的情況下,工作距離短孔徑角則大,數值孔徑大的高倍物鏡,其工作距離小。所以定義顯微鏡工作距離大小,主要看物鏡的參數。若需要長工作距離的進行觀察,可選擇長工作距離物鏡。

鏡像亮度 鏡象亮度是指顯微鏡中所看到的物象的亮暗程度。高倍率工作條件下的暗場、偏光、攝影顯微鏡等都需要足夠的亮度,與照明及物鏡的性能參數相關。鏡像清晰度是指圖像的輪廓清晰、襯度適中的程度。

鏡象亮度與物鏡性能參數之間的關系:鏡象亮度與數值孔徑的平方成正比,與總放大率的平方成反比。從使用和保管的角度來說,有許多地方值得注意,如蓋玻片的厚度不合格,調焦沒有調到理想位置,總放大率用的過大,使用油鏡后,沒有及時把香柏油檫干凈,鏡
片生霉生霧等,都會使象的清晰度受到破壞。

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