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如何正確的選擇使用熒光濾色片

時間:2018-11-27

在生命科學領域,隨著科研水平和實驗手段不斷的提高,熒光染色方法以其特異性強,使用相對于放射性元素更安全,檢測越來越靈敏等特點,受到越來越多的研究人員的認可,并且在實驗室中廣泛應用,成為經常性的實驗方法。

檢測熒光方法和手段根據不同的實驗要求和目的也多種多樣,使用最多的還是熒光顯微鏡,熒光酶標儀,流式細胞儀等。但是,無論何種儀器,無論儀器的性能如何,要得到準確的實驗結果,準確的實驗數據,最基本的條件就是根據所使用的熒光染料正確設置激發和發射波長。

下面我們以熒光顯微鏡的熒光濾色鏡為例,介紹一下濾色鏡組的構造以及根據染料,如何正確選擇濾色片。

熒光激發塊是熒光顯微鏡中用來激發熒光標本和觀察熒光的核心部件,它實際是濾色片的組合,一般含有3種濾色片:

1. 激發濾色片(Exciter Filter):選擇透過某個波段的光,來激發熒光染料。

2. 分色鏡 (Dichroic Mirror):反射激發光,透過熒光,一般激發光波長短,而發射光波長較長。

3. 發射濾色片(Barrier Filter) :透過發射光,也就是我們看到的“熒光”。同時阻擋各種雜散光和激發光的反射光。

根據熒光觀察的原理--熒光染料吸收特定波長的光(即激發光),躍遷到激發態,然后再釋放出特定波長的發射光(即熒光),回到基態。由此可知熒光染料所需的激發光和釋放的熒光都是特定波長的,所以需要利用各種濾色片來選擇性的透過某種特定波長的光來實現熒光觀察。否則,就會出現激發不了,激發了卻看不到或串色的現象。所以選擇合適的濾色片非常重要!

下面我們以熒光染料DAPI為例,闡述該如何選擇熒光激發塊。

通過上圖,我們可以了解到DAPI的激發光波長為300nm-410nm左右,激發峰值在360nm左右,也就是說激發光在300-410nm時可以激發DAPI染料,在360nm時激發效率最高。發射光波長為390nm-600nm,峰值在470nm左右。接著,我們就根據這些數據來選擇濾色片。

上圖為Olympus U-FUW激發塊的光譜信息。我們可以了解到此激發塊可以提供的激發光波長在300-400nm之間,剛好可以激發DAPI。允許透過的熒光光譜范圍也在410nm以上,所以此激發塊可以用來實現DAPI熒光染料的觀察。

讓我們再來看一個激發塊的光譜圖:

上圖為olympus U-FGW激發塊的光譜信息,可以看出此激發塊可以提供的激發光在530-560nm左右,允許透過的熒光光譜范圍在570nm以上,所以此激發塊并不適合DAPI激發。如果用此激發塊來做DAPI的觀察,就會出現看不到熒光的現象。

可見,要選擇合適的熒光激發塊,我們首先要知道熒光染料激發和發射光的波長特性和激發塊光譜的各項數據。但是,熒光染料和濾色片的種類非常多,用戶往往沒有渠道來獲取這些信息。在實際實驗中使用熒光顯微鏡時,因為熒光激發塊配置錯誤而得不到好的觀察效果的現象經常發生,對于用戶來說是一件非常煩惱的事。

為了方便用戶正確選擇激發和發射波長,節省時間,日本理化研究所腦科學所-奧林巴斯合作中心(theRIKEN BSI-Olympus Collaboration Center )開發了軟件Spectrum Manager。用戶選擇熒光染料,軟件會給出染料的光譜信息和推薦的濾色片選擇等信息,使用非常方便。

還可利用Data Manager自行對光源信息、染料數據庫或濾色片信息進行更新。

此款軟件已經整合至奧林巴斯共聚焦顯微鏡的一款軟件中,發布以來得到了用戶非常好的反響。因此,現將該軟件開放給所有顯微鏡使用者,供大家免費使用。

下載地址:http://cn.olympus.com/smkx_second/second.aspxnodeid=187&page=ContentPage&contentid=1011

由于是針對共聚焦顯微鏡的軟件,所以軟件中僅提供了激光光源譜線。如果您有需要,也可以將汞燈和氙燈光源信息導入至軟件。

以下提供普通熒光顯微鏡常用的汞燈和氙燈光源的圖譜,供大家參考。

汞燈在313, 334, 365, 406, 435, 546, and 578nm有比較好的激發峰。

氙燈在可見光光譜范圍內強度更穩定(沒有像汞燈那樣的光譜峰值),在紅外波段比汞燈強度高。但在紫外波段有一定的缺陷性。

所以選擇光源時,光源特性要與我們的具體應用相匹配。

一般來說人們都是確定了使用的染料再來選擇熒光激發塊。因為:1、做實驗之前通常都已經查閱了大量的文獻資料,然后根據參考文獻你知道哪幾種染料可以用在你將要實驗的標本上,再從中挑選最適合你的實驗設計的染料,選定了染料之后再確定你要使用的熒光激發塊;2、另外,我們所說的紅光或綠光其實是指熒光的發射光的顏色,根據熒光的原理:熒光的產生是由于某些物質的分子受到光刺激之后發生了能級變化,即分子中的原子受到光刺激后(吸收了能量)從低能級狀態躍遷到高能級狀態,由于高能級狀態很不穩定,很容易回到低能級狀態,根據能量守恒定律,從高能級狀態回復到低能級狀態的時候必然有能量的釋放(以輻射的形式),因此就有光的產生,這種光就是我們通常說的熒光。所以熒光的產生簡單地說就是stroke法則:短波長的光激發產生長波長的光。這就是通常我們說的紫外激發產生藍光,藍光激發產生綠光,綠光激發產生紅光。所以如果你用的染料是DAPI(發藍光),你就要選用紫外激發塊,如果你選擇GFP(綠光),你就要選用藍色激發塊以此類推。

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